AISLAMIENTO DE BRACHYSPIRAS

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BRACHYSPIRAS.

Aunque existen varios métodos de diagnóstico como la inmunocitoquímica, la inmunofluorescencia, o el PCR que son más rápidos que el aislamiento microbiológico, este último sigue siendo la prueba de referencia, además de que es el único que permite obtener la cepa, hacer antibiogramas, elaborar autovacunas, hacer estudios epidemiológicos, serotipar la cepa, etc.

Las características de cultivo de estas bacterias son muy especiales, por lo que este debe realizarse en laboratorios especializados que conozcan tanto el tratamiento que hay que dar a las muestras, como los medios de cultivo especiales y las condiciones de incubación.

¿cómo tomar las muestras?

Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio mediante cultivo a partir de 196 casos sospechosos quedan reflejados en la Tabla.

Sensibilidad del aislamiento de Brachyspiras por cultivo. Aislamientos y casos estudiados en los últimos 12 meses en Exopol; 196 casos.

De los 196 casos, hemos aislado al menos una especie de Brachyspira o Espiroqueta en 176 (90%) y además vemos que es posible encontrar infecciones mixtas en una misma explotación y en los mismos animales. Consideramos como Brachyspira spp aquellos aislamientos de brachyspiras b-hemolíticas (normalmente débil) que no han podido ser identificados por pruebas bioquímicas, y que mediante PCR (Laboratorios Adiagene, Francia) hemos podido confirmar que a menudo son mezcla de 2 o más cepas de diferentes especies de imposible separación. Llamamos Espiroquetas spp a las no hemolíticas y totalmente apatógenas. Además es importante destacar que en 39 casos en los que también se solicitaba la investigación de Lawsonia intracellularis, esta se detectó en 16.

La identificación fenotípica de los aislamientos permite diferenciar las especies B. hyodysenteriae, B. pilosicoli, B. intermedia, B. innocens y B. murdochii mediante varias pruebas de crecimiento y bioquímicas como son el tipo de hemólisis, prueba del anillo o hemólisis radial, indol, a-glucosidasa, b-glucosidasa, a-galactosidasa e hidrólisis del hippurato.

Características diferenciales de especies de Brachyspira

PROCESO DE AISLAMIENTO

a.- A partir de una extensión realizamos una tinción Gram para observar la presencia o ausencia de Espiroquetas. Si se observan se procede al sembrado para crecimiento y posterior identificación de la cepa aislada.	b.- Las heces, el raspado de la mucosa intestinal o el hisopo se disgregan en PBS con antibióticos.
c.- Se filtra el líquido obtenido.	d.- Siembra en agar sangre e incubación durante 48 horas en atmósfera anaerobia.Selección y resiembra en Agar Sangre de las de colonias hemolíticas.Confirmación de la especie por pruebas bioquímicas.
Aislamiento de Brachyspira hyodysenteriae en agar sangre incubado a 42 C en anaerobiosis. Procede de intestino de un porcino con sintomatología de diarrea profusa muco hemorrágica.	Pruebas bioquímicas de Brachyspira pilosicoli. a-glucosidasa negativo. a-galactosidasa positivo. b-glucosidasa negativo. Hidrólisis del hipurato positivo.
Pruebas bioquímicas de Brachyspira hyodysenteriae.	Cepa de Brachyspira pilosicoli en agar sangre incubado a 37 C en anaerobiosis. Cepa RW 2 cedida por el Dr. J Hommez (VZWO, Torhout Bélgica).

IDENTIFICACION DE BRACHYSPIRAS MEDIANTE PCR

El PCR además de método de diagnóstico directo, permite identificar las cepas aisladas cuando son una mezcla de varias especies. La técnica PCR disponible en Adiagene (Francia), basada en la amplificación del DNAr 16S, distingue entre las Brachyspira spp a B. hyodysenteriae, B. pilosicoli, B. intermedia y B. innocens, aunque estas dos últimas no las puede diferenciar entre si.

Identificación de Brachyspiras mediante PCR. Laboratorios ADIAGENE, Francia (www.adiagene.fr)

Fig 3 PCR amplificación ADNr 16S. Interpretación de resultados de la PCR: Bandas 1 y 4 (A): B. hyodysenteriae. Bandas 3 y 4 (B): B. Intermedia-innocens. Bandas 2 y 4 (C): B. pilosicoli.. Banda 4 solamente (D): Brachyspira sp. Si la banda 4 no se amplifica con la 1, 2 y 3, la prueba se considera negativa.Negativo cuando aparece una única banda correspondiente a la nº 5 (F). En todos los casos, la banda 5 puede amplificarse con otra. Si no se amplifica nada, se recomienda repetir la prueba (E).

En una colaboración llevada a cabo entre Exopol y Adiagene, el PCR ha confirmado como B. hyodysenteriae al 100% de los aislamientos identificados fenotípicamente como B. hyodysenteriae. La correlación obtenida entre los resultados obtenidos por PCR y por cultivo para el diagnóstico directo de B. hyodysenteriae a partir de 49 muestras de heces se muestra en la tabla.

Correlación entre el aislamiento por cultivo y el PCR en el diagnóstico de Disentería.