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M. J. Rodríguez, J. Sarraseca, P. Rueda. y J. I. Casal.
Ingenasa: Hnos. García Noblejas 41. 28037 Madrid. España.
Introducción
Una de las principales causas de pérdidas económicas en explotaciones porcinas son las enfermedades del aparato reproductor. El síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRS), la parvovirosis porcina (PP) y síndrome del desmedre post-destete (PMWS) relacionado con circovirus tipo II (PCV II) son tres patologías vírales que afectan a la reproducción y estan ampliamente extendidas en todo el mundo. Dada la similitud en los síntomas, (abortos, momificación de fetos, etc.), frecuentemente resulta conveniente la realización de un diagnóstico específico para estudios epidemiológicos y saneamiento de granjas. En muchos casos, la única y definitiva manera de confirmar la infección es por determinación de la presencia de virus mediante métodos extremadamente sensibles dados los bajos títulos de viremia y/o de anticuerpos a tiempos tempranos. Por otro lado existen evidencias de que estos virus pueden infectar persistentemente a cerdos.
El virus puede existir en el huésped a títulos más bajos de los que rutinariamente se detectan por métodos como el aislamiento del virus, detección de antígeno ó hibridación.
En el presente trabajo nos plantemos el desarrollo de ensayos de diagnóstico molecular basados en la amplificación del ácido nucleico del virus, individualmente para cada una de las patologías y de un ensayo múltiple para los tres. En los tres casos se utilizó la PCR para amplificar el ácido nucleico (RT-PCR para el virus-PRRS) y una sonda marcada específica del fragmento amplificado que detecta el producto de la amplificación en placa y es revelada por un anticuerpo conjugado a peroxidasa. Para la optimización de cada ensayo individual y para el desarrollo del ensayo multiple se tuvieron en cuenta las particularidades de cada virus.
Objetivos
Desarrollo de ensayos de diagnóstico molecular individuales basados en la amplificación del ácido nucleico de tres patologías vírales que afectan a la reproducción: El síndrome respiratorio y reproductor porcino , la parvovirosis porcina y síndrome del desmedre post-destete relacionado con PCV II.Detección del ácido nucleico amplificado mediante sondas específicas para cada patología, mediante revelado en placa.
Optimización de un ELISA-PCR multiplex para la detección simultanea de Parvovirus Porcino (PPV), PRRSV, y PCV.
El genoma de PPV está formado por una cadena sencilla de DNA de 5000 bases. A. Se eligió una zona conservada de la VP2 y se diseñaron parejas de cebadores que amplifican fragmentos de distinto tamaño (299, 500 y 1200 pb). La extracción se realizó mediante hervido de la muestra o extracción con fenol. Las condiciones de PCR se describen en la tabla. B. La sensibilidad y especificidad del método se analizó sobre la PCR de menor tamaño. Finalmente, se decidió utilizar el fragmento de tamaño intermedio 500 pb para eliminar la aparición de falsos positivos. La sensibilidad del método es 103 veces más sensible que la detección de antígeno mediante ELISA-DAS y mucho mas rápido que la detección de virus en cultivo. La PCR es capaz de detectar 1.1fg de virus. C. Comparación de la detección en gel y en ELISA.
Los pulmones proceden de animales con síntomas de PRRSV y los sueros de granjas saneadas que en algún momento tuvieron infecciones por PRRSV. En suero el limite de detección es de 21 días post-infección.
El PRRS es una patología producida por un virus ARN de cadena sencilla. El virus (PRRSV) se ha clasificado en dos genotipos: americano y europeo. Las diferencias al nivel de ARN entre ambos aislados son suficientes para llevar a cabo un diagnostico diferencial. Las zonas homologas permiten la detección de todos los aislados de PRRSV. A . Representación esquemática de las zonas elegidas para el diagnostico de cada aislado. B. Comparativa de los resultados obtenidos mediante detección en gel y en placa con sueros de los animales experimentalmente infectados con PRRSV europeo. C. Análisis de la especificidad del ELISA-PCR para cada genotipo en función de la temperatura de hibridación durante la PCR y comprobación de los primer generales. D.Condiciones de la RT-PCR. E. Resultados obtenidos con muestras de campo.
Los Circovirus (CPV) son virus ADN de cadena sencilla que se encuentra ampliamente distribuido en cerdos. Existen dos tipos I y II. El tipo II produce patología en cerdos cuando se encuentra asociado a PPV o PRRSV. Por el contrario, el tipo I no produce patología. Se seleccionaron cebadores específicos del CPV tipo II dentro de la ORF2 que codifica para la nucleocápsida del virus que es la región más variable entre ambos tipos. A . Se comprobó la especificidad para el tipo II con cultivos de células pK15 infectadas con virus tipo I (1) y celulas pK15 infectadas con la forma replicativa del DNA del virus tipo II (2). Las condiciones del ensayo se describen en la tabla . Con este ensayo se analizó una colección de 60 sueros sospechosos de circovirus resultando positivos 24.
El ELISA-PCR utiliza tres parejas de “primer” cada una especifica para cada patología y tres sondas específicas que se utilizan para el revelado en placa del producto amplificado. Las etapas que hay que unificar para la puesta a punto de un PCR-ELISA múltiplex son: proceso de extracción del ácido nucleico; PRRSV (RNA), PCV y PPV (DNA), selección del enzima, condiciones del termociclador, condiciones de hibridación para las sondas de cada patología. (tabla I)
Para la optimización de la PCR se evaluaron distintos parámetros. Temperatura de hibridación, concentración de iones Mg+2, concentración de oligonucleótidos. En una primera aproximación se observó que a temperaturas más bajas se sobre-amplifica PPV y a temperaturas mas altas se sobre-amplifican PCV y PRRSV. Se estableció una solución de compromiso realizando la PCR en dos fases de 15 ciclos de hibridación a 62ºC seguidos de 25 ciclos de hibridación a 55ºC (temperatura límite para la PCR de PPV). Dado que en estas condiciones seguía siendo muy superior la señal de PCV se disminuyó la concentración de los oligonucleótidos para esta patología.(tablaII) . Una vez establecidas las condiciones se comprobo la especificidad del ensayo.(tabla III).
Ejemplo de PCR-ELISA multiplex. Hibridación con cada sonda:1-PRRSV;2-PPV;3-CPV. Moldes utilizados: M1.- Acidos nucleicos de los tres virus amplificados a igual concentración de oligonucleótidos. M2.- Acidos nucleicos de los tres virus en las condiciones finales del ensayo. M3.-Pulmón PRRSV positivo + tejido intestinal de animal con PMWS. M1-M3(-),-control negativo de la PCR con H2O. C-. control negativo del ELISA. S+. PCRs simplex para cada patología.
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Indice
