Indice	Diagnóstico Serológico de Salmonelosis.
Indice	Ana Carvajal Urueña. Dpto. Sanidad Animal. Universidad de León. AVEDILA, León, octubre de 2003. Es evidente que las infecciones por Salmonella sp. son causa de pérdidas económicas más o menos notables para las explotaciones de las diferentes especies de animales domésticos pero es principalmente su repercusión desde el punto de vista de la salud pública la que ha animado enormemente el debate relativo al diagnóstico de estas infecciones. Salmonella es un importante agente de toxiinfecciones alimentarias y diversos productos de origen animal están implicados en brotes humanos de Salmonelosis. Consecuentemente, hoy en día existe un interés creciente en el desarrollo de técnicas de diagnóstico que puedan proporcionar información lo más precisa posible relativa tanto a la prevalencia de granjas infectadas como a la prevalencia de animales infectados dentro de una explotación. Los primeros programas de control de salmonelosis estuvieron basados en el establecimiento de medidas en diversos puntos de la cadena de producción de alimentos sin ocuparse de la detección de esta infección en los animales antes o en el momento de proceder a su sacrificio. Sin embargo, los principios de control de calidad más modernos indican que cada producto debe de ser evaluado en diversos puntos de la cadena y no de forma exclusiva en el final de la misma. La Unión Europea se hizo eco de esta situación y en el año 1992 estableció una primera directiva relativa al control de la salmonelosis en aves. Además, algunos países de nuestro entorno y de forma muy destacada Dinamarca ya han iniciado hace varios años programas de control en ganado porcino. La directiva comunitaria mantiene la bacteriología como sistema de detección de referencia en el diagnóstico de la salmonelosis, pero también indica la posibilidad del diagnóstico serológico imponiendo como única condición a estas técnicas de diagnóstico indirecto el que puedan probar una fiabilidad semejante a la del análisis bacteriológico. Podemos señalar varias ventajas del diagnóstico indirecto o serológico en comparación con la bacteriología, pero sin lugar a dudas, la principal es la solución que plantea al problema de la eliminación intermitente o en muy bajas concentraciones de Salmonella por los portadores crónicos de esta bacteria. Ambos factores obligan a emplear cantidades elevadas de materia fecal y a realizar muestreos repetidos sobre un cierto número de animales para poder descartar la infección por Salmonella en un colectivo empleando técnicas bacteriológicas. Además, la recogida de muestras de heces para el aislamiento bacteriológico implica la necesidad de llevar a cabo un envío urgente y refrigerado así como un procesado rápido en el laboratorio con el fin de evitar que pueda verse limitada la viabilidad de las bacterias presentes. Por su parte las técnicas de diagnóstico indirecto o serológico presentan una serie de ventajas. En primer lugar, los niveles de anticuerpos en el suero no fluctúan de la forma en que lo hace la eliminación de Salmonellas en heces y, por lo tanto, nos permiten hacernos una idea más clara de lo que puede estar ocurriendo tanto a nivel individual como a nivel de grupo o explotación. Una vez que se establece el contacto con el agente, los anticuerpos específicos comienzan a ser detectables en un periodo medio de 7-14 días en las distintas especies de animales domésticos y se mantienen más o menos estables durante un periodo de tiempo prolongado. Mientras que la bacteriología proporciona información actualizada de lo que le ocurre a un determinado individuo, la serología nos proporciona información acerca de la historia pasada del individuo o mejor de la explotación. Este pasado incluye desde aproximadamente los 15 días anteriores y hasta 4, 6 o incluso más meses antes de la realización del muestreo. También es evidente que el empleo de muestras de suero evita otros problemas inherentes a la recogida de heces: volumen, urgencia del envío o refrigeración. Además, y en este sentido, los esfuerzos dedicados al desarrollo de estas técnicas serológicas se han aprovechado para buscar aquellas muestras diferentes del suero donde podrían detectarse con la misma seguridad los anticuerpos anti-Salmonella. Así en el caso de las aves se han diseñado técnicas para la detección de los anticuerpos presentes en huevos o en muestras de sangre recogidas en papel de filtro, en el caso de cerdos se emplean técnicas basadas en la detección de anticuerpos en jugo de carne y en ganado bovino se han empleado técnicas en jugo de carne y también técnicas de detección de anticuerpos en leche. Otras ventajas de los métodos de diagnóstico indirecto en comparación con el diagnóstico microbiológico incluyen rapidez o menor coste, de gran importancia a la hora es establecer programas de control a gran escala. Sin embargo, también hemos de reconocer que el diagnóstico serológico de salmonelosis no está en absoluto exento de problemas. El primero y quizás el más limitante deriva de la propia complejidad antigénica de este género bacteriano englobado dentro de la familia Enterobacteriaceae. La estructura antigénica de las enterobacterias es tal que permite relacionar varios géneros entre sí y definir serológicamente un sinnúmero de especies bacterianas. Clásicamente, casi todos los géneros de enterobacterias, incluido el género Salmonella, se divididen en serotipos en base a los anticuerpos producidos frente a tres componentes antigénicos de superficie, el antígeno somático o antígeno O, el antígeno flagelar o antígeno H y, en algunos serotipos, en nuestro caso principalmente Salmonella Typhi o algunas cepas de Salmonella Dublin, el antígeno de superficie, antígeno de virulencia o antígeno Vi. Al diseñar una técnica para el diagnóstico indirecto de las infecciones por Salmonella debemos elegir entre técnicas específicas, capaces de detectar la respuesta inmunitaria inducida por un número limitado de serotipos o incluso un único serotipo, y técnicas de carácter general, capaces de detectar la infección por diferentes tipos o grupos de esta bacteria o incluso por todos o la gran mayoría de los serotipos o serogrupos implicados en las infecciones de una determinada especie. La primera técnica desarrollada para la detección de anticuerpos anti-Salmonella no es ni mucho menos reciente. En los años 40 comenzó a emplearse, con bastante éxito, una técnica de aglutinación en porta con sangre entera o con suero para la detección de lotes de aves infectadas por Salmonella Pullorum. Sin embargo las técnicas basadas en aglutinación tienen una limitada sensibilidad y son poco específicas y, en la actualidad, han sido superadas por técnicas ELISA principalmente. El primer paso y además el más determinante en el diseño de una técnica ELISA para la detección de anticuerpos anti-Salmonella es la elección del antígeno empleado para el tapizado de la placa. Como hemos indicado anteriormente al comentar la organización antigénica de estas bacterias tenemos dos aproximaciones principales, emplear el antígeno somático, antígeno O o lipopolisacárido (LPS), o emplear el antígeno flagelar o antígeno H. Aunque existen algunos otros ELISAs que emplean otras preparaciones antigénicas, sin duda los más importantes y más empleados en la actualidad son los LPS-ELISAs seguidos por los ELISAs basados en antígenos flagelares. LPS ELISA o O-ELISA Bajo esta denominación genérica podríamos englobar a todas las técnicas ELISA que se basan en el empleo del antígeno somático, antígeno O o LPS para el tapizado de las placas. El LPS es el antígeno inmunodominante en la gran mayoría de las bacterias Gram negativas. Hay que señalar que éstas son, sin duda, las técnicas más comunes y han sido ampliamente utilizadas tanto en aves como en ganado bovino o en porcino. De hecho, la gran mayoría de ELISAs comerciales y los programas de control puestos en marcha en diferentes países se basan en el empleo de estos ELISAs. El LPS es una molécula anfipática en la que pueden distinguirse tres regiones: el lípido A, el núcleo polisacárido propiamente dicho y el oligosacárido O. El lípido A es hidrofóbico y se localiza en la parte interna. En el caso concreto de Salmonella, el núcleo polisacárido está compuesto por cetodesoxioctonato, azúcares de 7 carbonos, glucosa, galactosa y N-acetilglucosamina. Por su parte, el polisacárido O está unido al núcleo, se proyecta hacia el medio externo en la superficie de la bacteria y es el determinante desde el punto de vista antigénico. Consta de azúcares de 6 carbonos como galactosa, glucosa, ramnosa o manosa así como de uno o más dideoxiazúcares poco frecuentes como abecuosa, colitosa, paratosa o tivelosa. Todos estos azúcares están unidos entre sí formando secuencias de 4 o 5 unidades que menudo se hallan ramificadas siendo la repetición de estas secuencias de azúcar la que da lugar a la formación del polisacárido O. El polisacárido O es la región más variable del LPS y la dominante desde el punto de vista antigénico. La respuesta inmunitaria mantiene una relativa especificidad respecto a los antígenos somáticos y así empleando estos antígenos podemos diseñar técnicas que nos permitan identificar animales infectados por un determinado serotipo o serogrupo de Salmonella. Sin embargo debemos reconocer que la especificidad es solo relativa y que se presentan notables reacciones cruzadas entre diferentes LPS debidas a la presencia de antígenos somáticos comunes en diferentes serotipos o serogrupos. Esta ausencia de especificidad puede ser empleada para el diseño de técnicas de carácter más amplio con el objetivo de detectar la infección por la gran mayoría de los serotipos de Salmonella que afectan a una determinada especie. Estos ELISAs están basados en la combinación de diferentes LPS, generalmente 2 o 3, en el tapizado de las placas y reciben la denominación genérica de Mix-LPS-ELISAs. Se requiere, evidentemente, una etapa previa para determinar los serotipos más frecuentemente presentes en cada especie y cada área geográfica con el fin de poder diseñar la técnica más adecuada. El LPS-ELISA y especialmente el Mix-LPS-ELISA es sin duda la opción más comúnmente empleada para el diagnóstico serológico de salmonelosis en la actualidad. De hecho es la técnica que se está utilizando en todos los programas de control puestos en marcha en el ganado porcino. En el caso de Dinamarca se incluye en el tapizado LPS de los serogrupos B y C1. Algunos países como Alemania emplean ELISAs semejantes mientras que otros se basan en mezclas antigénicas más amplias. En el caso de las aves también el programa de control puesto en marcha en Dinamarca en el año 1989, incluyó, a partir de 1996, el diagnóstico serológico con un Mix-LPS-ELISA que emplea para el tapizado antígeno somático de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, los dos serotipos más frecuentemente aislados en gallinas en este país. En ganado vacuno también se ha utilizado el LPS-ELISA tanto en muestras de suero como en leche o en jugo de carne. En este caso la gran mayoría de los trabajos investigan la presencia de anticuerpos específicos frente a Salmonella Dublin (serogrupo D1) o también Salmonella Typhimurium (serogrupo B), que parecen ser los dos serotipos predominantes. Es bastante complejo el poder hablar de la sensibilidad y especificidad de estas técnicas porque está en completa dependencia del serotipo o serogrupo implicado en la infección de los animales y del punto de corte fijado en la técnica. Los trabajos desarrollados por grupos daneses y holandeses indican que la sensibilidad del Mix-LPS-ELISA es semejante o superior a la del aislamiento de la bacteria en heces y órganos para Salmonella Typhimurium pero es notablemente inferior para Salmonellas del serogrupo C1 y nula para las del serogrupo C2. Respecto al punto de corte, debemos indicar que su determinación constituye un punto crítico en los protocolos de LPS-ELISA. Mientras que algunos autores lo establecen de forma clásica, es decir como el valor medio de absorbancia obtenido con una serie de sueros conocidos negativos más 2 ó 3 veces su desviación estándar otros muchos realizan la lectura en relación a los valores de absorbancia proporcionados por unos sueros positivos de referencia. En este segundo caso, en cada placa se incluyen sueros positivos y negativos de control y para cada suero problema se calcula el porcentaje de absorbancia respecto al control con la siguiente fórmula: [OD muestra — OD control negativo / OD control positivo — OD control negativo] * 100 El punto de corte se fija posteriormente entre el 10% y el 40%. En la elección de este valor juega un papel fundamental el empleo que se va a dar al resultado. Así, en el caso del Mix-LPS-ELISA que se emplea en el programa Danés de control de Salmonelosis en porcino se escogió inicialmente el punto de corte de 40% en lugar del 10%, teóricamente mucho más correcto, con el fin de comenzar a aplicar medidas de control en un número aceptable de explotaciones en las cuales la positividad fuera especialmente elevada. Tomando el aislamiento bacteriológico como técnica de referencia los valores de sensibilidad y especificidad relativas a nivel de explotación para el Mix-LPS-ELISA se encuentran alrededor del 90% y 30%, respectivamente, empleando un punto de corte del 10%. Tomando el punto de corte más elevado, 40%, la sensibilidad disminuye al 50% pero la especificidad alcanza el 90%. ELISA FLAGELAR Otra posibilidad en la selección de antígenos para el tapizado de placas de ELISA y el diagnóstico indirecto de salmonelosis es el empleo de antígenos flagelares. Estos antígenos flagelares pueden existir en dos fases y debemos indicar que, en principio, es limitada la información de que disponemos respecto a la expresión in vivo de estas dos fases en los diferentes serotipos de Salmonella. Cada célula bacteriana puede elaborar una sola fase flagelar pero cuando se trata de una población bacteriana, la proporción de bacterias que expresa cada una de estas fases puede variar. El mecanismo genético que controla este cambio de fase es bien conocido pero no se conoce igualmente el papel de factores medioambientales en la inducción de cambios de fase en Salmonella enterica. En lo que respecta a la respuesta inmunitaria debemos indicar que evidentemente también en este caso existe una respuesta específica frente a los diferentes antígenos flagelares así como reacciones cruzadas. Sin embargo, la mayoría de los autores coinciden en señalar que éstas son más limitadas que las descritas para el caso del LPS. En general y aunque diferentes estudios reflejan resultados variados, parece estar asumido que la aparición de inmunoglobulinas específicas frente a antígenos flagelares es muy temprana. Alcanzan el pico, la concentración más elevada, con anterioridad en comparación con los anticuerpos específicos de antígeno somático pero también es notable que desaparecen más tempranamente de forma que la mayoría de los autores coinciden en señalar que no son detectables a partir de los 4 meses postinfección. Además, la respuesta inmunitaria parece ser bastante menos homogénea que la de los anticuerpos específicos anti-O y así algunos autores no llegan a detectarlos o los detectan en un número muy limitado de animales tras infecciones experimentales. Este hecho es especialmente notable en el caso de cepas o serotipos poco invasivos. Quizás la aplicación que más frecuentemente se da a los ELISA basados en el empleo de antígenos flagelares sea la diferenciación de la reacción inmunitaria inducida por serotipos que comparten determinados antígenos somáticos. Así, en el caso de aves se han diseñado técnicas basadas en el empleo de antígeno flagelar que permiten distinguir infecciones causadas por Salmonella Enteritidis de infecciones por Salmonella Gallinarum o Salmonella Pullorum, todas ellas del serogrupo D pero no flageladas las dos últimas o también infecciones causadas por Salmonella Typhimurium del serogrupo B y por otros serotipos del serogrupo D que comparten antígenos somáticos. OTROS ELISAs Han sido diseñados otros ELISAs para la detección de anticuerpos anti-Salmonella que emplean para el tapizado de las placas antígenos diferentes al antígeno somático o al antígeno flagelar. Algunos de ellos se han basado en el empleo de antígenos fimbriales. Las primeras pruebas de diagnóstico basadas en la detección de antígenos fimbriales fueron desarrolladas en los años 70 para la detección de E. coli enterotoxigénico. Aunque la expresión de fimbrias por algunas cepas de Salmonella era conocida desde hace más de 40 años y fue empleada en la puesta a punto de técnicas de hemaglutinación, ha sido recientemente cuando estos antígenos han comenzado a ser estudiados en mayor profundidad. En la actualidad han sido descritas una gran variedad de fimbrias en este género bacteriano que han sido clasificadas en diferentes grupos que presentan reacciones inmunitarias cruzadas entre ellas. Las fimbrias de grupo 1 incluyen la fimbria SEF21 descrita inicialmente en Salmonella Enteritidis. Las de tipo 2, entre las que se incluyan fimbrias observadas inicialmente en Salmonella Pullorum y Gallinarum, están muy próximas a las del grupo 1 tanto molecular como antigénicamente y son consideradas como variantes no hemaglutinantes de las fimbrias de tipo 1. También existen fimbrias de tipo 3 y tipo 4 descritas recientemente en Salmonella Dublin. La fimbria SEF14 fue descrita inicialmente en Salmonella Enteritidis y es específica de ciertos serotipos del serogrupo D. Aunque Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum presentan los genes que codifican para esta fimbria no la expresan y por ello este antígeno fimbrial ha sido empleado en el diseño de técnicas ELISA específicas para Salmonella Enteritidis que han sido empleadas en pollos. Otros diseños de ELISA están basados en el empleo de proteínas de membrana y/o porinas, del antígeno Vi (polisacárido capsular) o de antígenos de naturaleza proteica obtenidos de células completas sometidas a sonicación. Algunos de ellos proporcionan sensibilidades óptimas pero sus principales limitaciones suelen estar asociadas a una escasa especificidad. El ELISA denominado como SalAD, Salmonella Antibody Detection, está basado en el empleo de antígenos obtenidos mediante un tratamiento de extracción por calor, seguido de purificación mediante centrifugación y concentración por filtración. Ha sido probado en porcino empleando para el tapizado de las placas mezclas antigénicas extraídas de los serotipos Typhimurium, Enteritidis, Cholerasuis y Anatum obteniéndose resultados muy semejantes a los del Mix-LPS-ELISA aunque evidentemente la experiencia con este ELISA es muy inferior y sería deseable poder contar con alguna información adicional relativa a los componentes antigénicos presentes en los antígenos extraídos mediante el tratamiento térmico. De todo lo anteriormente expuesto podemos destacar que gracias a la intensa labor de investigación desarrollada durante los últimos años, hoy en día disponemos de diferentes técnicas ELISA para el diagnóstico indirecto de la salmonelosis de los animales domésticos. Su aplicación principal es el diagnóstico a nivel de explotación y su utilidad es enorme, especialmente si se desean llevar a cabo planes de control a gran escala. Sin embargo, debemos siempre tener en cuenta este diagnóstico serológico requiere del apoyo constante de la bacteriología convencional que permita conocer la situación inicial así como la evolución de los serotipos más predominantes para una determinada especie animal y en un determinado área.
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