Indice	INMUNOMARCAJE
Indice	¿Que es el Inmunomarcaje? Cuando utilizamos un anticuerpo para localizar un antígeno hablamos de Inmunomarcaje. El Inmunomarcaje se emplea para hacer diagnóstico, pero también para identificar tipos celulares, localizar orgánulos dentro de las células, etc. Cuando trabajamos con tejidos hablamos de Inmunohistoquímica y cuando trabajamos con células individualizadas de Inmunocitoquímica. El Inmunomarcaje es una técnica muy utilizada, de hecho se comercializan miles de anticuerpos diferentes que reconocen muchos patógenos, tipos celulares, proteínas, etc. (http://www.antibodyresource.com/). De hecho, en los últimos 12 meses se han publicado más de 8.500 trabajos científicos que utilizaron alguna de estas técnicas (Búsqueda realizada en Pub Med el 8-8-01 con las palabras clave Inmunoperoxidase e Inmunofluerescence). Especificidad del Inmunomarcaje El resultado del Inmunomarcaje depende del anticuerpo y de la técnica empleada, pero en cualquier caso puede ser exquisitamente específico, por ejemplo y utilizando microscopia electrónica, podemos localizar y distinguir unas proteínas intracelulares de otras proteínas adyacentes http://www.aecom.yu.edu/wormem/b.htm, o podemos ver como se distribuyen varias estructuras dentro de una misma célula, v.g. túbulos, marcando unas de rojo y otras de verde (http://www.itg.uiuc.edu/exhibits/gallery/pages/image-84.htm ; http://www.itg.uiuc.edu/exhibits/gallery/pages/image-1.htm). Análogamente, y utilizando anticuerpos bien referenciados frente a los patógenos de interés veterinario, podemos hacer un diagnóstico de muy elevada especificidad. Además el Inmunomarcaje permite una comprobación morfológica del patógeno, por ejemplo en el caso de bacterias y parásitos, y la marcación específica del sitio donde se produce la replicación y/o el ensamblaje de los virus (citoplasma vs. núcleo). La técnica del Inmunomarcaje (ver también IPX ) Esencialmente, sobre un trozo de tejido o sobre una población celular individualizada que hemos fijado sobre un porta, añadimos anticuerpos que son específicos frente a la estructura que queremos reconocer, v.g. un virus. En el caso más sencillo este anticuerpo lleva unido la peroxidasa o un elemento fluorescente y hablamos de Inmunoperoxidasa o Inmunofluorescencia Directa. Decimos Directa porque el anticuerpo está marcado, sin embargo muy frecuentemente el anticuerpo primario no este marcado y utilizamos un anticuerpo secundario que sí lo esta y hablamos de Inmunoperoxidasa o Inmunofluorescencia Indirecta. En la Figura entendemos mejor el proceso. Sobre un porta en el que se han fijado las células o el tejido, añadimos un anticuerpo primario específico para el antígeno que queramos estudiar (v.g. un virus). Tras una serie de lavados para eliminar todo el anticuerpo que no se haya pegado a las proteínas del virus que están expresadas en la superficie celular, añadimos un anticuerpo secundario marcado. En el caso de utilizar peroxidasa, tras varios lavados para eliminar el exceso de anticuerpo marcado, añadimos un sustrato y una tinción de contraste. El resultado se puede visualizar en el microscopio óptico a 1000 aumentos (Foto. 2, BVD y Foto 3, PRRS).   Fig nš 3 Virus BVD (Diarrea vírica bovina) detectado en citoplasma de linfocitos mediante imunoperoxidasa indirecta (coloración roja). Se realizó un cultivo de linfocitos a partir de sangre entera heparinizada, y se marcó con un anticuerpo monoclonal que reconoce el género Pestivirus p80 / p125 (NS23). Microcopía de campo claro 1000 x. Los linfocitos no infectados aparecen de color azul. A veces algunos antígenos son totalmente intracelulares (v.g. Toxoplasma o Neospora), en estos casos hemos de "permeabilizar" las células para conseguir que los anticuerpos y sustratos reconozcan a los antígenos. El Inmunomarcaje en la detección de anticuerpos También podemos utilizar portas con el antígeno fijado para buscar la presencia de anticuerpos, v.g. células infectadas con Coxiella burnetti o Lawsonia intracellularis. Sobre estos portas añadimos el suero problema de un animal sospechoso. En su caso, los anticuerpos frente a C. burnetti o L. intracellularis se unirán al antígeno del pocillo y para evidenciar está unión y tras lavar el primer suero, utilizamos un segundo anticuerpo que reconoce específicamente sólo a las IgG de ovino o de porcino y que estará marcado con peroxidasa o fluorescencia. El suero problema lo podemos titular utilizándolo a diferentes diluciones y se considera positivo cuando a una dilución definida se produce el Inmunomarcaje.     Fig nš 4 Encephalitozoon cuniculi detectado en células renales de conejo mediante inmunoperoxidasa indirecta. Se empleó un anticuerpo policlonal en conejo. Microcopia de campo claro 1000 x. Animales de cebo con sintomatología nerviosa, parálisis de músculos mandibulares y barbilla mojada. Diagnóstico diferencial con Toxoplasma gondii, Listeria monocitógenes y Chlamydia psittaci. Anticuerpos monoclonales vs policlonales. Para obtener un anticuerpo podemos inocular un animal con un antígeno, v.g. un ratón. El sistema inmune del ratón activará varias células plasmáticas diferentes frente a ese antígeno, y cada una de ellas producirá sólo un tipo anticuerpo que será diferente a los demás y que reconocerá a partes diferentes del antígeno. A estos anticuerpos los denominamos policlonales, porque en realidad son una mezcla de varios anticuerpos producidos por varias células plasmáticas. Por su naturaleza los anticuerpos policlonales pueden reconocer a algunas partes del antígeno (epítopos) que reaccionan cruzadamente con otros patógenos. Por ejemplo, esto es lo que pasa en los falsos positivos producidos por Yersinia frente a Brucelosis. Por supuesto, estos sueros se pueden purificar mucho mediante absorciones que eliminen a aquellos anticuerpos que reconozcan a otros antígenos no deseados.   Para fabricar anticuerpos monoclonales seleccionamos a una sola célula plasmática y la hacemos inmortal "in vitro" fusionándola con una célula tumoral. De este modo producimos anticuerpos que sólo reconocen un epítopo de cada antígeno y que lógicamente son más específicos que los anticuerpos policlonales. También puede haber monoclonales que reconozcan a más de un patógeno porque están hechos frente a un epítopo que comparten más de un patógeno y de hecho a veces son útiles. Por ejemplo, podemos utilizar un monoclonal que reconozca a todos los Pestivirus (BVD, Border o PPC) o a todas las Clamidias (C. psitacci, trachomatis, pecorum, etc.). Las limitaciones de la técnica En el diagnóstico por Inmunomarcaje, la mayor limitación es la escasez de anticuerpos totalmente específicos frente a cada uno de los patógenos de interés veterinario. Por ejemplo, no existen anticuerpos monoclonales específicos para muchas de las especies de Mycoplasmas implicadas en veterinaria, para Mycobacterium paratuberculosis o Erysipelothrix rhusiopathiae entre otros. En estos casos hay que trabajar con anticuerpos policlonales que, por la razón arriba apuntada, pueden dar lugar a falsos positivos. Puedes ver unas fotos de algunos casos estudiados: Neospora, PRRS, Brachispiras spp, Cl. novyii.
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